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代謝在細胞和生理過程中的作用已經(jīng)很明確，現(xiàn)在認為許多疾病都與代謝功能障礙或重編程有關。安捷倫 Seahorse XF 技術(shù)簡化了細胞能量代謝分析。該技術(shù)利用免標記方法實時測量活細胞的兩條能量代謝通路，量化細胞代謝表型，從而分析細胞功能的變化。

     XF 技術(shù)通過測定氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate, OCR)來反映細胞線粒體的功能，通過測定細胞外酸化速率(Extra Cellular Acidification Rate，ECAR)來反映糖酵解功能。

     將細胞接種到孔中，并可以將多四種藥物（例如抑制劑或激動劑）自動添加到細胞中。在探針板中，每個探針四周排列了四個集成的加藥口。將藥物依次注入孔中，并通過探針與檢測液混合。實時測定藥物誘導的細胞代謝動態(tài)變化。

提問

Qustions&解答Answers

Seahorse XF 實驗常見問題及解答

01可以使用超出保質(zhì)期的探針板或重復使用探針板嗎？

     Agilent 無法保證因使用超出保質(zhì)期的探針板或重復使用探針板而得到的實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量(有效性)，為得到較佳的、較真實的數(shù)據(jù)，請使用有效期內(nèi)的探針板及其它消耗品。

02探針板水化超出水化時間怎么辦？

     Agilent建議將探針板放入37℃無CO2培養(yǎng)箱中水化過夜以得到較優(yōu)結(jié)果。短水化時間是37℃水化12小時。探針板長水化時間是37℃水化72小時，但由于液體蒸發(fā)需要補充(或更換)校準液，因此37℃無CO2培養(yǎng)箱務必放置水盤保證濕度。

03Fluxpak各種探針板有什么區(qū)別？

     探針板是Fluxpak的組成部分，一個Fluxpak包含探針板、水化板、校準液和細胞培養(yǎng)微孔板。以上各消耗品數(shù)量因所購Fluxpak類型而不同。探針板不能單獨訂購，必須通過訂購Fluxpak來購買，但細胞培養(yǎng)板和校準液可單獨購買。訂購前，需要了解使用機器的型號及所需要的實驗次數(shù)，訂購與之配套的Fluxpak。

04計劃明天做實驗，我今天要做些啥？

     實驗前一天，打開主機，打開電腦，同時點開Wave軟件，確保是Connected的狀態(tài)，水化探針板，貼壁細胞提前接種到Seahorse的細胞培養(yǎng)板里。

05探針板水化聽說有二步，是這樣嗎？

     是的，96孔探針板，實驗前一天，用無菌水；第二天做實驗前，棄去無菌水，更換上37℃預熱好的校準液，再放置無CO2恒溫箱孵育1小時，這樣二步法水化，較大程度避免了探針頭上的小氣泡；24機型探針板一步法水化即可，但是還是建議用之前手動排一下氣泡；

06一次實驗可以只使用探針板其中的一部分嗎？

     為了將所有藥物或化合物成功地注入細胞培養(yǎng)孔中，Agilent建議水化整個探針板并因需要將相同字母標注的全部加藥孔注入藥物（請參考實驗流程中關于加載藥物的注意事項）。背景孔的加藥孔也必須加上藥物，保證所有的A加藥孔體積一致，B、C、D孔同理，否則會造成打藥失??；

07實驗中為何必須設置背景校正孔？

     背景校正孔被用來過濾掉實驗的干擾因素，比如溫度和 buffering capacity，這些干擾因素會影響氧含量和pH變化（非來源于代謝變化的影響）。背景校正孔還能被用來修正整板間溫度波動，來診斷潛在溫度問題，以及作為實驗獲得非期望數(shù)據(jù)時原因篩查的切入點。

08背景校正孔怎么設置？

      背景校正孔里除了沒有細胞，其它所有操作和細胞孔一致。96機型背景校正孔（A1,A12, H1, H12，即4個角）不接種細胞；24機型背景校正孔設置為（A1, B4, C3, D6）；確保背景校正孔中只加入培養(yǎng)液（無細胞）

09為何細胞培養(yǎng)板需要在 37℃無CO2 培養(yǎng)箱中放置45-60min？

     細胞培養(yǎng)板在37℃無CO2培養(yǎng)箱中孵育45-60min的目的是為了脫氣，釋放CO2。

10 Seahorse 實驗時，我擔心細胞量少，我多種點細胞可以嗎？

     細胞的密度需要摸索，在實驗上機前，長滿板底面積80-90%為較佳，設置一個密度梯度，找到較佳的密度；細胞過密會使檢測時形成的瞬間微室氧氣快速耗盡。

11 Seahorse 實驗，種細胞和平時種細胞有區(qū)別嗎？

      安捷倫細胞培養(yǎng)板種細胞時候，槍頭抵壁，與水平面呈45°角度加入，加完在超凈臺靜置1小時，有助于促進細胞均勻分布并減少邊緣效應。96孔細胞板種80ul；24機型的板子分二步，先每孔接種100 μL細胞懸液，培養(yǎng)細胞1-6小時，細胞貼壁后，再補充生長培養(yǎng)基，每孔加入150μL生長培養(yǎng)液,總體積為250 μL。加液時沿壁輕輕加入，避免吹起剛貼壁的細胞。 

12 使用組織黏附劑處理細胞培養(yǎng)板會影響XF實驗測量嗎？

     不會。使用諸如poly-L-Lysine，fibronectin，Gelatin，poly-D-lysine，Cell-Tak™等組織黏附劑處理細胞培養(yǎng)板時，不會影響XF儀器測量的效果及實驗參數(shù)分析。

13 XFp/XFe96細胞培養(yǎng)微孔板的每個細胞孔的大體積及底面積是多少？

       275 µL；底面積是正常96孔板底面積的40%。

14 XFe24細胞培養(yǎng)微孔板的每個細胞孔的大體積及底面積是多少？

      1000 µL；底面積和正常96孔板底面積一樣大小。

15 Seahorse XF檢測液中需要加入抗生素嗎？

      無需加入抗生素，因為大部分XF實驗在幾小時內(nèi)就結(jié)束了。

16可以在Seahorse檢測液中加入血清嗎？

      不建議加入血清（如：FBS），因為其會影響檢測液的緩沖能力，并可能與進行檢測的藥物/化合物發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測效果，同時容易產(chǎn)生氣泡。另外，使用加入血清的檢測液溶解藥物加載至探針板加藥孔中進行注射時，會出現(xiàn)漏藥或加藥注射失敗。

17加入底物的檢測液在多長時間內(nèi)可保持穩(wěn)定？或可以提前配好檢測液和藥物嗎？

      Seahorse檢測液在實驗當天現(xiàn)用現(xiàn)配。藥物也要現(xiàn)配現(xiàn)用，溶解后的藥物要一次性用完，剩余的也不能用于下次實驗了。

18 Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒中的藥物狀態(tài)看上去很奇怪，是否有質(zhì)量問題（或其他試劑盒中部分藥物）？

      如Glycolysis stress test kit中的2-DG，該藥可能是透明的液體、不透明的（白色的）固體，也可能是白色固體與透明液體的混合物，以上藥物狀態(tài)均不影響其性能，可按照說明書正常溶解使用。

19使用pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 基礎培養(yǎng)基制備檢測液時，加上Seahorse的三個底物，是否就無需調(diào)整pH了？

      是的。使用推薦的 XF 三個底物，能確保分析培養(yǎng)基終 pH 值的準確。如果使用其他供應商提供的其他品牌的補充劑，則無法保證培養(yǎng)基pH 值的準確。啟封后的pH7.4的DMEM或RPMI基礎培養(yǎng)基，盡可能在一個月內(nèi)用完，以免pH值因為空氣中的CO2進去，影響pH值。

20Seahorse的基礎培養(yǎng)基與其他廠家的有啥不同？

       Seahorse XF 培養(yǎng)基于 XF 分析，推薦研究者使用，以獲得較佳試驗結(jié)果。XF 培養(yǎng)基以標準細胞培養(yǎng)基組分（DMEM 或 PRMI）為基礎，做了以下這些方面改進：

 無碳酸氫鹽和低緩沖容量：利于細胞外酸化率的檢測 

 無底物添加：適用于用戶的各種不同需求 

 低濃度酚紅或無酚紅：確保 pH 值測量的準確性 

21請問進行FAO實驗時，能夠在探針板上加載BSA-palmitate使其在上機測量時自動注射入細胞孔嗎？

      Agilent建議將BSA-palmitate或相似底物在培養(yǎng)細胞時做預處理。如果實驗存在合理依據(jù)需在上機測量時通過注射加BSA-palmitate、血清或其他類似底物，請聯(lián)系相關技術(shù)支持。

22 為何不能使用XF base medium配制的檢測液進行Glycolytic rate與real-time ATP rate兩個實驗？

      XF base medium中含有酚紅，該物質(zhì)會影響這兩個實驗的測量。

23 為何不能使用GlutaMAX來代替Glutamine呢？

     不建議使用GlutaMAX來配制檢測液。因加入GlutaMAX后，還需細胞進一步將其轉(zhuǎn)化為glutamine，這可能會影響線粒體對Glutamine氧化的動力學過程。

24 檢測液的pH對XF實驗非常重要嗎？

    是的，Seahorse XF實驗通過測定細胞代謝物（如：氧和質(zhì)子）的變化來確定OCR 和ECAR，而檢測液pH會影響這些代謝物的產(chǎn)生或消耗，因此保持檢測液一致的 pH（37℃，pH=7.4± 0.1）非常重要。

25 FluxPak中的水化板可以替代細胞培養(yǎng)板嗎？

      不可以，雖然水化板與細胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)相同，但不能用來培養(yǎng)細胞。

26 Seahorse 探針板上機前加藥，需要注意什么？

       加藥時同樣方法，槍頭抵著加藥孔壁大約與水平面呈45°度角，將液體一次性加入到加藥孔中，注意板子始終保持在平面上，加完藥的探針板不能晃動，以免加入的液體漏入水化板中。（24的機型，在加藥前需要取下粉色的水化輔助板）；

27 Seahorse 細胞板上機時候，放進去應該就可以了？

       探針板和細胞板放入儀器時，朝向為A1孔朝向機器內(nèi)部，記得把蓋子拿掉；

28 Seahorse XF報告生成器中的代謝數(shù)據(jù)是如何計算的？

      在每個試劑盒的Seahorse XF報告生成器的用戶指南中詳細列出了數(shù)據(jù)的計算公式，請參閱。

29 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件Wave可以免費下載安裝嗎？

      是的，可在安捷倫找到Wave軟件下載，并且免費下載安裝。

30 Seahorse XF 儀器模板選項中沒有想檢測試劑盒的模板怎么辦？

     可在桌面板wave軟件中將相應實驗模板先導出到 U 盤中，再導入XF 儀器模板庫即可。

31 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件導出選項中沒有對應的report generator？

      當軟件導出選項中無相應的report generator時，請移步到Agilent細胞分析軟件下，下載wave分析軟件，也可以在對應試劑盒的菜單中下載對應的report generator。

32 Seahorse Wave 分析軟件，我的電腦怎么都安裝不上，怎么辦？

     當軟件無法安裝時，可采用 Seahorse Analytics云分析， 這是一款網(wǎng)頁形式的 Seahorse XF 數(shù)據(jù)分析軟件，用戶可以通過任何一臺電腦安全地存儲、訪問和分析數(shù)據(jù)。較大地簡化了用戶的數(shù)據(jù)分析流程

33 Seahorse XF 實驗后，是否需要做歸一化處理呢，有哪些方法呢？

     功能生物數(shù)據(jù)的歸一化是原始數(shù)據(jù)展示和后續(xù)分析工作流程中的關鍵因素，以確保對結(jié)果的準確一致的解析。XF 代謝分析在這方面也是如此，大多數(shù)實驗需要進行某種形式的歸一化。無論是比較不同的細胞類型、基因修飾還是化合物處理，都必須根據(jù)共同的參數(shù)將數(shù)據(jù)歸一化以便正確比較。

     常用的方法，蛋白定量，細胞成像計數(shù)，核DNA的檢測等。

34 購買的Fluxpak包裝，為啥細胞板總是多幾塊呢？

    Agilent 充分考慮到實驗中的各種情況，如果你發(fā)現(xiàn)細胞種的過密了或者發(fā)生了污染，那么就需要更換新的細胞板重新鋪板。

35 Seahorse相關試劑存儲條件是怎么的呢？

      Agilent 基礎培養(yǎng)基類，請4℃避光保存，避免凍結(jié)。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃；板子及常見的試劑盒，室溫存儲即可。

36 Seahorse XF 相關試劑盒的說明書在哪呢，有中文的嗎？

   Agilent 一直提倡遵循環(huán)保理念，當您收到試劑盒后，標簽面都有一個二維碼，掃描即可下載說明書。部分有中文說明書，請聯(lián)系相關技術(shù)支持索取。

37 Seahorse XFe24 組織胰島板能簡單介紹下嗎？

     目前只要24機型配有組織胰島微孔板，其微孔板的腔室容積為16.6 µL；

其網(wǎng)狀捕獲篩孔徑為125 µm。

38 Seahorse 啥數(shù)據(jù)能大致判斷實驗結(jié)果靠譜不？

      通過大量的結(jié)果數(shù)據(jù)，24機型基礎OCR值范圍50～400(pmol/min)，基礎ECAR值范圍20～120(mpH/min)；96機型基礎OCR值 范圍20～160(pmol/min)，基礎ECAR值范圍10～90(mpH/min)。這個范圍內(nèi)的值，還是比較靠譜的。

3 Seahorse  24/96 孔微孔板的尺寸是多少？